Microbiología Bact. Fernando Anselmino
El área Microbiología Molecular reúne proyectos orientados al desarrollo de nuevas estrategias diagnósticas y estudios moleculares de patógenos bacterianos, virales, micológicos y parasitarios, su relación con el medio y con el hospedador. Abarca diversas especies de importancia en salud humana y producción.
Detección y tipificación de HPV
El Virus del Papiloma Humano (HPV, del Inglés, Human Papilloma Virus) pertenece a una extensa familia de virus que infecta al ser humano, produciendo lesiones verrugosas en la piel y en las mucosas.
En realidad, la familia de los HPV está compuesta por varios virus similares, que fueron denominados con números consecutivos a medida que se iban descubriendo, existiendo hoy más de 100 tipos identificados. De ellos, algunos tipos producen las conocidas verrugas vulgares, otros producen verrugas genitales, llamadas condilomas, otros producen infecciones el cuello uterino y la vagina y unos muy pocos infectan estos tejidos pero haciéndolos proliferar en forma anómala, originando lesiones preneoplásicas que después se pueden transformar en un cáncer.
La infección por HPV del tracto genital femenino puede ser detectada precozmente. La sospecha de una infección por HPV es efectuada por el ginecólogo al momento de realizar una colposcopía, y confirmada con un examen de Papnicolaou o con una biopsia. Sin embargo, a veces estos exámenes no alcanzan a confirmar las sospecha del ginecólogo, por lo que se debe recurrir a un aislamiento por bilogía molecular, buscando material genético del virus.
Aunque el Papnicolaou haya confirmado la existencia de una infección por HPV, aún resta por conocer si el subtipo viral es potencialmente neoplásico o no. Esto se realiza mediante una tipificación de subtipos virales, en el mismo proceso de aislamiento del virus por biología molecular.
El resultado de esta tipificación permite establecer dos catgorías de infecciones, las producidas por virus pocos agresivos y las producidas por virus potencialmente peligrosos.
El HPV es contagioso, aunque las posibilidades de contagio son bajas. Sin embargo, las infecciones genitales por HPV pueden ser transmitidas en ambos sentidos dentro de una pareja, y es común que ambos miembros de la misma estén infectados, aunque en el varón la infección es de menor intensidad y puede pasar desapercibida.
Este concepto es importante, ya que una mujer tratada puede volver a infectarse si no existe un tratamiento para el varón.
La infección genital por HPV se presenta en casi el 50% de todas las mujers con vida sexual activa, siendo la edad promedio de aparación la de 22 años, aunque el rango es muy amplio, apareciendo desde muy temprana edad con casos de adolescentes de menos de 15 años y también en mujeres post-menopáusicas. La incidencia aumenta proporcionalmente con la cantidad de parejas sexuales previas o actuales.
De todas las infecciones genitales por HPV, las que son peligrosas por su evolución hacia un cáncer comprenden un 20-30%, aunque a priori no se conoce qué mujer va a evolucionar así y cual no.
De aquí que sea importanate la prevención mediante un chequeo periódico, un examen citológico de Papnicolaou y la eventual tipificación del virus en caso de sospechar esta infección.
Esta prevención permite adelantarse a los acontecimientos en mucho tiempo, impidiendo un diagnóstivo tardío, donde las posibilidades terapéuticas son más agresivas o no son tan eficaces.
Detección de Chlamydias, Mycoplasmas y Ureaplasmas en pacientes de sexo femenino
Las infecciones del tracto genitourinario debidas a Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum son las principales causas de morbilidad en la población sexualmente activa, siendo frecuentemente aislados del tracto genital femenino. Mundialmente, la tasa de infección por estos agentes se está incrementando. Actualmente, la infección por Chlamydia trachomatis es la enfermedad de transmisión sexual más común, con tasas de prevalencia del orden del 5 al 8% en la población general. En las mujeres, las infecciones por Chlamydia pueden dejar secuelas severas como inflamación pélvica, embarazos ectópicos e infertilidad por daño en las trompas de falopio. El Ureaplasma urealyticum es un organismo comensal del tracto urogenital de las mujeres sexualmente maduras y las infecciones del corioamnios se encuentran estrechamente asociadas con los nacimientos prematuros, así como con altas tasas de morbilidad y mortalidad perinatal. Durante los últimos 15 años el diagnóstico de infecciones causadas por estos microorganismos ha sido altamente dependiente de métodos tradicionales como la inmunofluorescencia directa (TIF), enzimainmunoensayo (EIA) y Cultivo. La detección de estos agentes se ha realizado principalmente a partir de hisopados del tracto genital femenino e hisopados uretrales en el caso de los hombres. Los intentos por realizar cultivos a partir de muestras de primera micción han brindado resultados muy pobres, sugiriendo la presencia de inhibidores en la orina.
En los últimos 5 años se ha diversificado la utilización de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) como el método de elección y referencia. Esta técnica ha mostrado ser altamente específica y extremadamente sensible, superando la sensibilidad obtenida por los métodos de cultivo y TIF. Por otra parte, ha sido demostrado que las técnicas de biología molecular pueden ser realizadas partiendo de una amplia variedad y calidad de muestras. Entre ellas, la utilización de muestras de primera micción como material de estudio ha sido ampliamente convalidada. Este tipo de muestras se obtienen de forma no invasiva y pueden ser de gran utilidad para el diagnóstico de estos microorganismos en personas del sexo masculino, muchos de los cuales presentan infecciones asintomáticas, actuando como reservorios de estos agentes.
Numerosos estudios han demostrado que la detección de Chlamydias, Mycoplasmas y Ureaplasmas por la metodología de PCR es sumamente sensible y específica. Además, las condiciones de traslado de las muestras no requiere de los cuidados necesarios para la realización de los cultivos: las muestras pueden permanecer a temperatura ambiente hasta por 7 días. Este hecho demuestra una enorme ventaja de la técnica PCR por sobre los métodos tradicionales. Por otra parte, pueden realizarse estudios retrospectivos sobre muestras que han sido fijadas e incluidas en parafina ya que lo que se estudia es la presencia de material genético de los microorganismos, permitiendo así en muchos casos identificar al agente etiológico por ejemplo en casos de abortos espontáneos. Al estudiar el material genético de los agentes, pueden detectarse pequeñas variaciones que se traducen en el fenotipo del microorganismo.
Detección de Streptococco ß-hemolítico de Grupo B por métodos de Biología Molecular
En la década de 1970, el estreptococo del grupo B (Streptococcus agalactiae o GBS) fue reconocido como un patógeno de gran importancia en las enfermedades neonatales. Los estreptococos del grupo B son responsables de sepsis y meningitis neonatal, con una mortalidad que oscila entre el 10% y el 25%. En los países desarrollados, la implementación de programas de rastreo y quimioprofilaxis durante el embarazo han llevado a una reducción sustancial de la morbilidad y mortalidad causadas por este patógeno.
Entre los años 1993 y 1997 las estrategias de prevención basadas en análisis de riesgo o en la detección del patógeno han logrado reducir la incidencia de las enfermedades neonatales asociadas a la infección por GBS de 1,7 a 0,4 por cada 1.000 nacimientos vivos.
Hasta el momento, los métodos clásicos de detección del Streptococcus agalactiae se han basado en el cultivo selectivo de hisopados vaginales y perianales colectados entre las semanas 35 y 37 del embarazo, con la subsecuente identificación de los microorganismos sospechosos. Pero, los métodos clásicos de cultivo, aislamiento e identificación poseen una limitación: poseen una sensibilidad relativamente baja, cercana al 85%, brindando resultados negativos cuando la carga bacteriana es baja.
En los últimos años, la biología molecular ha aportado nuevas aproximaciones para el estudio y diagnóstico de innumerables patologías y, entre ellas, la detección de agentes microbiológicos de acción patógena se ha convertido en una de las áreas mejor cubiertas.
Los ensayos realizados en el diagnóstico de Streptococcus agalactiae en mujeres embarazadas han mostrado que la metodología de PCR posee una sensibilidad superior respecto de los métodos tradicionales, brindando a la vez un valor predictivo positivo y negativo superior al 98%. Considerando además que la detección del patógeno se realiza a través de cebadores o sondas específicas de factores propios del Streptococcus agalactiae (Factor de CAMP) y que los ensayos de control con cientos de especies bacterianas dan resultados negativos, transforman al método de PCR en la técnica de elección al momento del rastreo de Streptococcus ß-hemolíticos del grupo B durante el período de embarazo.
Detección de Mycobacterium tuberculosis por PCR
Los métodos para el diagnóstico de la tuberculosis han mejorado en los últimos años y varias técnicas moleculares para su diagnóstico han sido introducidas para su uso clínico. Sin embargo, el frotis de esputo teñido con la técnica BAAR, el cultivo de esputo y la radiografía de tórax siguen siendo los principales instrumentos utilizados por la mayoría de los médicos clínicos para el diagnóstico de la tuberculosis pulmonar. Algunos de estos métodos tradicionales requieren de semanas antes de que se produzcan los resultados y, además, la sensibilidad de estas técnicas es relativamente baja cuando las muestras de esputo contienen sólo un pequeño número de microorganismos.
Varios métodos, basados en la amplificación de ADN y ARN, han demostrado ser sensibles y específicos para la detección rápida de Mycobacterium tuberculosis en muestras de esputo y fluidos corporales. Estos métodos proporcionan varias ventajas sobre los cultivos, incluyendo la confirmación de la presencia de M. tuberculosis en 1 a 3 días de tomada la muestra, en comparación con las 2 a 6 semanas requeridas por las técnicas de cultivo. Además, la utilización de técnicas de amplificación de ADN para la detección de M. tuberculosis en muetras de tejido fijadas en formol e incluídas en parafina podrían ser útiles para los pacientes en quienes el diagnóstico depende del examen del tejido en lugar de la detección de M. tuberculosis en las secreciones corporales.
Por desgracia, hay ocasiones frecuentes en donde el tejido obtenido por biopsia no se envía para cultivo porque el diagnóstico de tuberculosis no era una consideración clínica antes del informe de los hallazgos en el examen microscópico de los tejidos. La Reacción en cadena de polimerasa (PCR) para la detección del ADN de M. tuberculosis puede proporcionar una ayuda muy necesaria en estas circunstancias, porque esta metodología puede detectar M. tuberculosis en muestras de tejido conservado en formol u otras sustancias que impiden la utilización de las técnicas de cultivo.
Detección de Herpes simplex I/II por PCR en tiempo real
Varios métodos diagnósticos han mostrado ser fiables para la detección y subtipificación de las infecciones por el virus del Herpes simplex (HSV), incluyendo el ensayo de ELISA, la microscopía de inmunofluorescencia (IF) y el aislamiento del virus en cultivos celulares. Aunque cada uno de estos métodos ha sido muy útil para el diagnóstico clínico, el tiempo y el progreso tecnológico han puesto de manifiesto las limitaciones de estos ensayos. Los tres ensayos son laboriosos y requieren mucho tiempo, para el cultivo celular a menudo se requieren hasta siete días antes de la obtención de resultados. La sensibilidad de estas técnicas también ha sido cuestionada, sobre todo en referencia a metodologías más recientes, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La velocidad y la sensibilidad de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) la han convertido en el método más popular para la detección de agentes microbiológicos, tanto en la investigación como en el diagnóstico clínico. Para la detección y determinación del genotipo del virus del herpes simplex (HSV) en muestras clínicas, el PCR en tiempo real ha demostrado ser más rápido, más sensible y más seguro que los métodos anteriores que incluían el aislamiento del virus en cultivo celular, seguido por microscopía de inmunofluorescencia o el clásico PCR en tiempo final. Mientras que los ensayos basados en PCR para la detección de HSV poseen claras ventajas sobre las técnicas anteriores de cultivo o serológicas, ciertos aspectos del método de PCR siguen siendo limitantes.
